40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью на своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, когда Эцио после разговора с Минервой бежит из Рима вместе со своим дядей Марио Аудиторе. После, фамильная резиденция рода Аудиторе - Монтериджони осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погибает его родной дядя Марио. После этого действие игры переносится в 1500 год, где Эцио вынужден организовать и начать развивать «подполье» (в которое входят Римские воры, куртизанки, а далее и рекруты-ассасины), когда начинает возрождаться орден, лидером которого формально был Николло Макиавелли, который после передаст титул Эцио. На протяжении игры Эцио пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание.
В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные туннели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе для того, чтобы найти Яблоко Эдема и остановить надвигающуюся катастрофу. Из воспоминаний Эцио становится ясно, что тот спрятал яблоко Эдема под Колизеем в Риме. Команда отправляется туда, чтобы забрать яблоко, они проходят катакомбы, и находят искомое. Как только Дезмонд взял в руки яблоко, оно овладело им и заставило ударить Люси скрытым клинком в область живота (неизвестно, жива ли Люси или нет). Оба они падают без сознания. После, два неизвестных находят героев и подключают Дезмонда к «Анимусу», так как тот был в состоянии сильнейшего шока, а спасти его можно было только так. В конце дополнения «The Da Vinci Disappearance» из разговора незнакомцев становится ясно, что одного из них зовут Уильям (вероятно, тот, с которым переписывалась Люси), а Дезмонд впал в кому.

Assassin’s Creed: Brotherhood — первая игра серии, в которой реализован мультиплеер. Как было показано во время побега из штаба организации «Абстерго» в начале игры Assassin's Creed II, тамплиеры построили специальный объект, содержащий в себе несколько десятков устройств «Анимус». Этот объект служит полигоном для подготовки новобранцев ордена с целью ликвидации Ордена Ассасинов. Тамплиеры намерены использовать технику и приспособления своих предков, используя воспоминания самых квалифицированных из тамплиеров.
В мультиплеере будет представлен 21 класс персонажей, из которых: 14 базовых, 4 появляющихся с определенным уровнем, 1 покупной за Uplay очки и 2 доступных в коллекционной и подарочной версиях игры. у каждого из которых имеется своя особая техника убийства и свой комплекс навыков и оружия. В игре присутствуют 8 различных режимов мультиплеерной игры: Розыск (англ. «Wanted»), Сложный розыск (англ. «Advanced Wanted»), Альянс (англ. «Alliance»), Сложный альянс (англ. «Advanced Alliance»), Убийство (англ. «Assassination»), Охота (англ. «Manhunt»), Эскорт (англ. «Escort»), Охота за сундуками (англ. «Hunt for chest»)/ Мультиплеер игры осуществляется через игровые сети Xbox Live, PlayStation Network. Также появились в сети новые подробности о мультиплеере: существует 21 класс — 10 начальных, 5 бонусных, 2 платных, а также 4 класса из дополнения «The Da Vinci Disappearance».

The Da Vinci Disappearance
Компания Ubisoft официально сообщила о выходе в марте нового дополнения для приключенческого экшена Assassin’s Creed: Brotherhood. Дополнение, которое получило название The Da Vinci Disappearance (Исчезновение Да Винчи), включает новый контент как для одиночной, так и для мультиплеерной составляющих. В сюжетной части Эцио придется спасти Леонардо да Винчи, который был похищен герметистами, посетив в ходе этого приключения две новые локации. Мультиплеерная часть дополнения включает новые карты, два новых режима (Escort и Assassinate), и четырех персонажей: Dama Rossa, Knight, Marquis и Pariah. Этот DLC вместе с ранее выпущенными (кроме Copernicus Conspiracy) присутствует в комплекте РС-версии Assassin’s Creed: Brotherhood, которая вышла 17 марта.

Награды, присуждённые игре до её выхода
По результатам выставки E3 2010 авторитетное онлайновое издание IGN.com провело конкурс «Призы лучшим играм выставки E3» (англ. «Best of E3 Awards»), и присудило игре победу в номинации «Лучшая экшен-игра» (англ. «Best Action Game»). А читатели ресурса GameSpot избрали игру лучшей в номинации «Лучший приключенческий экшен выставки E3» (англ. «Best Action Adventure game of E3»).
На этой же выставке официальное жюри присудило игре победу в номинации «Лучший онлайн мультиплеер» (англ. «Best Online Multiplayer») в рамках конкурса «Game Critics Award».

- Люси Стиллман на своём компьютере играет в онлайн игру Assassin’s Creed: Project Legacy. Это другой проект Ubisoft.
- Вилла Монтерриджони, представленная в игре в двух типах (классической и современной), не имеет ни одного сходства со своим реальным прототипом.
- В оригинальной версии игры, если отправлять ассасинов выполнять задания в Москве, сама Москва обозначена где-то на границе Украины и Польши.
- На карте мира в игре страны Европы имеют современные границы, хотя события происходят в начале XVI века. Впрочем, этот ляп присутствует во всех играх серии.
- Когда Дезмонд первый раз выходит из убежища наверх, он надевает часы и наушник, которые лежат на ящике, и на протяжении всей игры их не снимает. Однако, если после этого зайти в Анимус и снова из него выйти, часы и наушник опять будут лежать на том же месте, хотя в это же время они на Дезмонде.
- После прохождения последовательности, в которой нужно спасти Катерину Сфорца даётся достижение под названием «Твоя принцесса в другом замке…», что является прямой отсылкой к игре Super Mario Bros.
- В некоторых кат-сценах орёл на футболке Дезмонда повёрнут то влево, то вправо.
- Когда Эцио плавает, он практически не совершает никаких движений ногами.
- Если отобрать у дворника метлу, её можно использовать в качестве оружия.
- События в настоящем происходит в 2012 году. Во время одного из разговоров Люси говорит: "Сегодня 8 октября, значит спутник запустят через 74 дня". С помощью простейших арифметических подсчётов дата запуска спутника получается -21 декабря - день зимнего солнцестояния. Во время последней миссии с Дезмондом (проходит 2 дня) Юнона намекает на конец света через 72 дня. 21 декабря 2012 года - предположительный конец света по календарю Майа.
- Минерва, с которой Эцио в начале игры вступил в "диалог", является римской богиней мудрости, а Юнона - древнеримской богиней брака и рождения, материнства, женщин и женской производительной силы и супругой Юпитера.
- Также арбалетом можно совершать контратаки.